不同浓度淫羊藿苷修复骨损伤：争议与探索

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.023

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (2): 301-306.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.023

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不同浓度淫羊藿苷修复骨损伤：争议与探索

朱鸿飞¹，郑军¹，徐小燕²，汤伟忠¹，年华¹，周恩元¹

1上海中医药大学附属岳阳医院，上海市 200437；2同济大学材料学院，上海市 200092

收稿日期:2013-11-23 出版日期:2014-01-08 发布日期:2014-01-08
通讯作者: 郑军，硕士，副主任医师，上海中医药大学附属岳阳医院骨伤科，上海市 200437
作者简介:朱鸿飞，男，1985年生，江苏省溧阳市人，汉族，2012年上海中医药大学毕业，硕士，医师，主要从事关节、脊柱疾病方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81072958)

Different concentrations of icariin for bone defect repair: disputes and exploration

Zhu Hong-fei¹, Zheng Jun¹, Xu Xiao-yan², Tang Wei-zhong¹, Nian Hua¹, Zhou En-yuan¹

1Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200437, China; 2College of Material Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China

Received:2013-11-23 Online:2014-01-08 Published:2014-01-08
Contact: Zheng Jun, Master, Associate chief physician, Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200437, China
About author:Zhu Hong-fei, Master, Physician, Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200437, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81072958

摘要/Abstract

摘要：

背景：作为淫羊藿主要有效成分之一的淫羊藿苷，对于骨损伤后的修复具有重要作用。淫羊藿苷在体内的持续有效浓度对于骨损伤的修复至关重要。
目的：综述近年国内外淫羊藿苷对于骨修复的研究进展，探讨淫羊藿苷的药理活性浓度。
方法：第一作者应用计算机检索2000年1月至2013年10月PubMed数据(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/PubMed)及CNKI中国期刊全文数据库(http://www.cnki.net/)有关淫羊藿苷对骨组织修复作用，或者与淫羊藿苷治疗骨损伤的相关基础研究文献。英文检索词“icariin，concentration，bone”；中文检索词“淫羊藿苷，浓度，骨”。排除重复性研究，共检索到76篇相关文献，44篇文献符合纳入标准。
结果与结论：利用淫羊藿苷的有效活性成分联合缓释支架材料，可以诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，增强成骨细胞活性，抑制破骨细胞的吸收，从而起到修复骨组织的作用。淫羊藿苷促进细胞分化作用虽已得到肯定，但是否具有促进细胞增殖作用还存在一定的争议。研究发现，淫羊藿苷的药理活性浓度从10-8到10-5 mol/L不等，总体来看，10-8-10-5 mol/L应该是淫羊藿苷发挥其最佳药理活性可能出现的区间，但目前临床试验尚未开展，具体的持续给药浓度还不确定，这些都需要进一步研究探索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 淫羊藿苷, 骨修复, 支架, 骨髓间充质干细胞, 成骨细胞, 破骨细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: As one of the main active ingredients in epimedium, icariin plays an important role in bone defect repair. Sustained and effective concentration of icariin in vivo is essential for bone damage repair.
OBJECTIVE: To recommend the research progress of epimedium glycoside for bone repair and to explore the pharmaco-active concentration of icariin.
METHODS: A computer-based online search of CNKI database (http://www.cnki.net/) and PubMed database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed) from January 2000 to October 2013 was performed for related articles of the effect of icariin for bone defect repair and bone damage repair. The key words were “icariin, concentration, bone” in Chinese and English. After repeated articles were excluded, 76 related articles were screened out and 44 of them met the inclusive criteria.
RESULTS AND CONCLUSION: The icariin-released scaffold materials can induce the osteogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells, promote the viability of osteoblasts and inhibit the resorption of
osteoclasts, thus repairing bone tissue. It is certain that icariin promotes cellular differentiation, however whether it can promote cellular proliferation remains unclear. The pharmaco-active concentration of icariin ranges from10-8 to 10-5 mol/L, but clinical trial has not yet been carried out, and specific drug concentration is uncertain, which needs further exploration.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

Key words: traditional Chinese medicine, flavonoids, stents, mesenchymal stem cells, osteoblasts

中图分类号:

R318

朱鸿飞，郑军，徐小燕，汤伟忠，年华，周恩元. 不同浓度淫羊藿苷修复骨损伤：争议与探索[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(2): 301-306.

Zhu Hong-fei, Zheng Jun, Xu Xiao-yan, Tang Wei-zhong, Nian Hua, Zhou En-yuan. Different concentrations of icariin for bone defect repair: disputes and exploration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(2): 301-306.

图/表（结果） 1

2.1 不同浓度淫羊藿苷对于骨髓间充质干细胞、成骨细胞及破骨细胞的作用研究骨髓来源的间充质干细胞作为最早被认识的一类间充质干细胞，对于骨髓造血干细胞具有良好的支持作用，良好的增殖和分化能力使其在细胞替代治疗、组织工程创伤修复以及基因治疗等方面具有广阔的应用前景。成骨细胞(osteoblast)位于骨组织表面，是骨形成以及损伤后修复重建过程中的重要功能细胞，淫羊藿苷能通过多种途径促进成骨细胞的增值与分化，并且促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，这是骨修复的关键。破骨细胞作为骨细胞的一种，在功能上与成骨细胞相对应，行使骨吸收的功能。细胞的成骨分化是一个十分复杂的过程，需要成骨特异基因和蛋白的不断调控，在其发生、发展的各个阶段均需借助于基因、转录因子、细胞因子、激素以及局部微环境的精细调控。(bone resorption)

2.1.1 淫羊藿苷对于骨髓间充质干细胞的促分化作用淫羊藿苷具有雌激素样结构,通过抑制骨吸收,诱导骨髓间充质干细胞成骨分化起到促进骨修复的作用。蒋绍艳等^[5]发现淫羊藿苷可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，可将其视为一种良好的骨诱导活性因子。贾东升等^[6]发现淫羊藿苷能通过促进骨髓间充质细胞成骨分化，并抑制骨髓间充质细胞向脂肪细胞分化，起到增强成骨细胞活性的作用，从而很好地对抗骨质疏松。杨丽等^[7]以20 mg/L淫羊藿苷作为间充质干细胞药物干预浓度，发现转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2的表达量明显上调，分析淫羊藿苷可能通过上调其表达量促进间充质干细胞向成骨细胞分化。吴昊等^[8]采用10^-11-10^-4mol/L浓度淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞诱导增殖，发现最佳促骨髓间充质干细胞骨向分化浓度为10^-9mol/L。研究发现，不同浓度的淫羊藿苷对于细胞因子的表达所起的作用也不尽相同。谢玲玲等^[9]采用不同浓度淫羊藿苷对大鼠间充质干细胞进行干预，发现10^-7和10^-5 mol/L 2个淫羊藿苷组对于大鼠骨髓间充质干细胞增殖和分泌血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子的促进作用更显著。

碱性磷酸酶作为骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化及细胞外基质成熟的早期标志物，是参与骨代谢的重要蛋白质，对于体外的钙化起着非常重要的作用，并且在骨髓间充质干细胞成骨分化的过程中可能起到中间桥梁的作用。周建等^[10]分别用浓度为1×10^-5mol/L的淫羊藿苷和蛇床子素对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞进行干预，于不同的时间点测定碱性磷酸酶活性和钙含量，RT-PCR检测转录因子Runx-2、OSX，骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原mRNA表达水平。结果发现该浓度淫羊藿苷和蛇床子素干预均能提高碱性磷酸酶活性并增加Ca含量，提高转录因子Runx-2、OSX、骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原mRNA的表达水平，且淫羊藿苷提高骨髓间充质干细胞成骨性分化活性明显强于蛇床子素。Yin等^[11]将骨髓间充质干细胞经诱导分化为成骨细胞，采用5，10，20和40 mg/L淫羊藿苷进行培养，发现浓度为10 mg/L和20 mg/L淫羊藿苷能够使碱性磷酸酶活性增加并且增加矿化结节数量，而浓度在20 mg/L淫羊藿苷能够更好地促进碱性磷酸酶的表达和钙化结节生成，显著提高骨形态发生蛋白2 mRNA的合成。宋鹏等^[12]采用1×10^-5mol/L的淫羊藿苷干预大鼠骨髓间充质干细胞的成骨性分化，发现淫羊藿苷显著提高了细胞中碱性磷酸酶的活性, 增加了钙化结节数,并且升高了成骨性相关因子骨形态发生蛋白2和Runx-2的基因表达量。Mao等^[13]通过体外培养间充质干细胞株C3H10T1/2，给予淫羊藿苷(0, 10^-7, 10^-6, 10^-5和 10^-4mol/L)联合成骨诱导液进行干预，碱性磷酸酶染色观察成骨分化情况，结果显示10^-5mol/L淫羊藿苷联合成骨诱导液促进C3H10T1/2细胞成骨分化能力最强，推断淫羊藿苷促进间充质干细胞株C3H10T1/2向成骨细胞分化，其作用可能与激活p38和抑制ERK蛋白的表达有关(表1)。

2.1.2 淫羊藿苷促进成骨细胞增殖与分化的研究大量体外实验证实，淫羊藿苷对于成骨细胞的增殖、分化及钙化有积极的促进作用。淫羊藿苷可以通过抑制成骨细胞凋亡，使骨形成增加，骨吸收减少，从而发挥促进骨骼生长的作用^[14]。Hsieh等^[15]研究发现淫羊藿苷是体外骨合成代谢剂，其成骨效应表现在可以诱导骨形态发生蛋白2和一氧化氮的合成，并调节核心结合因子α1/Runx2，骨保护素和核因子κB受体活化因子配体基因的表达，通过这种途径可能起到促进成骨细胞增殖和分化的作用，进而促进骨骼形成。柯勇等^[16]分别用10，20，40 μg/L的淫羊藿苷作用于MC3T3-E1细胞，观察细胞生长情况，发现各组淫羊藿苷均可以促进成骨细胞增殖，增加成骨细胞骨形态发生蛋白2的表达，其中 20 μg/L组作用更为显著。但也有学者研究发现淫羊藿苷对于成骨细胞的作用并非直接促进其增殖，而是通过改变成骨相关基因的表达起到促进成骨细胞分化的作用。Zhao等^[¹⁷^]采用10^-10-10^-5mol/L淫羊藿苷培养前成骨细胞株MC3T3-E1细胞，发现10^-5mol/L浓度淫羊藿苷对于提高成骨相关基因的表达作用显著。何伟等^[18]通过实验发现10^-8-10^-4mol/L的淫羊藿苷对成骨细胞并没有增殖促进作用，而是促进了成骨细胞的碱性磷酸酶活性；同时研究表明在10^-6mol/L浓度下，成骨细胞核心结合因子α1(转录因子)、骨形态发生蛋白2，4 mRNA的表达明显上调，表明淫羊藿苷可能通过上调核心结合因子α1、骨形态发生蛋白2，4 mRNA的表达来促进成骨细胞分化。

淫羊藿苷可以通过多种途径增强成骨细胞活性，促进成骨细胞分化。研究发现，淫羊藿苷对成骨细胞Ⅰ型胶原的表达和骨钙素的合成具有明显的促进作用，可以刺激体外培养成骨细胞的增殖、分化和矿化^[19]。转录因子OSX、Runx-2在成骨细胞的分化、成熟中扮演重要角色，并且Runx-2 蛋白参与成骨形成的早期阶段^[20-22]。翟远坤等^[23]采用终浓度分别为10^-4，10^-5，10^-6，10^-7 mol/L的淫羊藿苷对体外培养大鼠乳鼠颅骨成骨细胞进行药物干预，发现浓度为10^-5 mol/L的淫羊藿苷可显著增加钙化结节和成纤维细胞集落形成单位碱性磷酸酶数量，促进与成骨相关的转录因子Runx-2与Osterix mRNA的表达，同时也可增强Ⅰ型胶原蛋白的分泌，提示淫羊藿苷有较强的促骨形成活性。马小妮等^[24]用10^-5mol/L的淫羊藿苷干预原代培养大鼠颅骨成骨细胞，结果显示，与对照组相比，淫羊藿苷能明显促进骨形成，表现为转录因子Runx-2、OSX、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原基因表达量及Ⅰ型胶原蛋白表达量显著增加 (P均< 0.01) ，同时提高细胞内钙离子浓度。骨保护素/核因子κB受体活化因子/核因子κB受体活化因子配体系统对于成骨、破骨细胞功能的调控作用非常重要。张秀珍等^[25]发现不同浓度淫羊藿苷均可促进大鼠成骨细胞表达骨保护素mRNA，同时抑制核因子κB受体活化因子配体mRNA的表达，且以10^-7mol/L作用最显著。整合素作为应力受体，在调节成骨细胞生长环境方面亦起着重要作用。雷涛等^[26]以不同浓度淫羊藿苷与成骨细胞孵育，结果显示各淫羊藿苷干预组Ⅰ型胶原、整合素α2和β1的表达均升高，且以10 μg/L浓度组表达最高。关于淫羊藿苷对于成骨细胞增殖、分化的促进作用的研究很多，但浓度的最佳选择却一直没有定论。钱卫庆等^[27]予不同浓度淫羊藿苷对体外培养大鼠成骨细胞干预，观察发现10 μg/L淫羊藿苷对成骨细胞的生长增殖、分化均有促进作用，且作用较其他各浓度组更强，更持久，说明该浓度淫羊藿苷能显著增强其成骨活性。Xiao等^[28]发现，不同浓度淫羊藿苷对于大鼠成骨细胞表达骨保护素和Ⅰ型胶原mRNA表达的促进不同，10 mg/L浓度作用最明显；而Zhang等^[29]采用2.0×10^-9-1.0×10^-5mol/L淫羊藿苷培养原代大鼠颅骨成骨细胞,发现均能够促进碱性磷酸酶的表达，但各浓度组表达的生理活性并无明显差异，说明可能在某个浓度范围之内，淫羊藿苷对碱性磷酸酶的表达均有促进作用，但却不能确定哪个浓度是最佳浓度(表1)。

2.1.3 淫羊藿苷对破骨细胞的抑制作用破骨细胞是高度分化的多核巨细胞，其主要功能就是直接参与骨吸收。淫羊藿苷对于骨修复的作用机制相当复杂，骨组织一旦发生破坏，正常的成骨-破骨细胞功能平衡即被打破，而淫羊藿苷在增强成骨细胞活性的同时对破骨细胞也有明显的抑制作用^[30-31]。Huang 等^[32]研究发现淫羊藿苷可抑制巨噬细胞-集落刺激因子/核因子κB受体活化因子配体诱导的破骨细胞祖细胞分化为破骨细胞，因此认为破骨细胞祖细胞可能是淫羊藿苷发挥减少破骨细胞数量的靶细胞。吕明波等^[33]通过对不同浓度的淫羊藿苷刺激破骨细胞的研究发现, 10^-6，5×10^-6，10^-5mol/L浓度的淫羊藿苷组破骨细胞凋亡率均明显增高, 骨吸收陷窝数目、面积明显减少，其抑制作用随浓度增加而增强。张大威等^[34]观察不同浓度淫羊藿苷对经诱导兔骨髓单核细胞形成破骨细胞样细胞的作用，发现浓度为100，50 μmol/L的淫羊藿苷明显抑制1，25-(OH)₂D₃诱导兔骨髓单核细胞形成破骨细胞样细胞的数目，表明淫羊藿苷不仅对于破骨细胞的分化具有明显抑制作用，而且对其骨吸收功能也具有明显的抑制作用。在破骨前体细胞分化发育为成熟破骨细胞的过程中，骨髓基质细胞和骨保护素/核因子κB受体活化因子/核因子κB受体活化因子配体系统起主要调节作用。骨保护素直接与核因子κB受体活化因子配体结合，竞争性抑制核因子κB受体活化因子配体和核因子κB受体活化因子结合，起到抑制破骨细胞分化和骨吸收活性的作用^[35-37]。骨保护素/核因子κB受体活化因子配体的比值越低则骨吸收越强；比值越高，则骨吸收越低。Xie等^[38]发现，淫羊藿苷在促进成骨细胞骨保护素分泌的同时，对于核因子κB受体活化因子配体的表达也有抑制作用，进而使核因子κB受体活化因子配体与骨保护素的相对比例发生变化，破骨细胞的活性随之降低，抑制骨吸收(表1)。

2.2 淫羊藿苷在组织工程领域的应用组织工程支架作为细胞附着的基本框架和代谢场所，理想的支架传导系统应具备以下特点：①生物相容性好，具有良好的细胞亲和力。②一定的孔径和三维立体多孔结构，空隙率达90%以上，利于细胞的生成与代谢。③一定的柔韧性与刚性，使之能提供一个支撑与机体组织贴合，同时不会对机体造成损伤等。④良好的生物降解性，其降解速度与细胞的增殖速度相匹配，最终被机体完全代谢或吸收^[39]。目前，组织工程细胞支架的材料主要有两类：一类是无机材料：如羟基磷灰石等；另一类是有机高分子材料：如壳聚糖等。羟基磷灰石是骨组织的有效无机成分，已有实验证明羟基磷灰石可以促进间质干细胞的成骨化分化，是公认的骨修复替代材料^[40-41]。壳聚糖作为可降解多糖，因其带有大量正电荷，容易制备成纳米微粒，且生物相容性好，塑形容易，已被作为较好的药物载体而广泛应用于组织工程研究^[⁴²^]。但单一羟基磷灰石构建的材料因无机物的脆性大，尚不能很好地在负重骨修复领域应用。实验证明将羟基磷灰石与壳聚糖复合可以综合2种材料的优点，降低材料的脆性，使抗弯强度增高，将有机相与无机相结合起来，使复合材料具备优异的力学性能与生物性能。现在，越来越多的研究常将两种材料复合，整合2种材料的优点以得到具有更好性能的材料。这类生物材料支架塑形性强，具有良好的生物相容性和可降解性，并且可以避免异体组织中免疫排斥反应，在降解的同时，使种植骨或软骨细胞不断增殖，起到修复骨缺损的作用。淫羊藿苷在体内需要合适的载体才能较好的发挥其生物学活性，纳米粒子或微囊的体积超微，作为药物控释的良好载体，能够直接作用于细胞，可以增加药物稳定性，延长药物持续浓度，增强药物疗效，目前已被广泛应用于组织工程领域，而骨组织工程临床治疗骨缺损已成为骨科研究的热点。而淫羊藿苷纳米颗粒与羟基磷灰石-壳聚糖的结合更是综合了传统中医药的优势，近年来相关方面的研究虽然仍不多，但却已吸引了大批学者的浓厚兴趣。李慕勤等^[43]通过碱性磷酸酶活性测定法，比较羟基磷灰石-丝素蛋白/壳聚糖/淫羊藿和传统生物支架对成骨细胞的增殖作用，结果显示差异有显著性意义(P < 0.05)，说明羟基磷灰石-丝素蛋白/壳聚糖/淫羊藿具有更好的促进成骨细胞增殖的作用，其作为骨组织工程支架材料的可行性强。

目前，淫羊藿苷的药理学浓度问题以及有效持续时间问题是发挥淫羊藿苷功效的关键所在，一直没有完全解决。Wu等^[44]研究了1.0×10^-9-2.0×10^-4mol/L浓度淫羊藿苷的药理活性和细胞毒性，实验结果表明低于 10^-8mol/L的淫羊藿苷细胞毒性很低；10^-5mol/L淫羊藿苷与对照组相比虽显示出了一定的细胞毒性，但是其存活率仍高于91%，而10^-4mol/L淫羊藿苷对细胞的抑制作用则较为显著(存活率为85%), 2.0×10^-4mol/L浓度更是极大地降低了细胞存活率，仅为71%，说明10^-4mol/L淫羊藿苷具有细胞毒性。同时他们也发现，高剂量载药对壳聚糖/羟基磷灰石复合材料的骨传导有降低作用，这可能与高载药量使壳聚糖/羟基磷灰石复合材料物理、力学性质发生了负面作用，而10^-6mol/L浓度淫羊藿苷其生理活性最强，对骨修复的促进作用也最显著。有学者对载药量分别为0.5，1.0，1.5 g/L的纳米羟基磷灰石/壳聚糖载淫羊藿苷膜的体外释放进行了研究，结果发现随着含药量的增大，释放量也逐渐增大，不同浓度的淫羊藿苷膜均明显促进了间充质干细胞的增殖。

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目前，组织工程细胞支架的材料主要有两类：一类是无机材料：如羟基磷灰石等；另一类是有机高分子材料：如壳聚糖等。羟基磷灰石是骨组织的有效无机成分，已有实验证明羟基磷灰石可以促进间质干细胞的成骨化分化，是公认的骨修复替代材料。壳聚糖作为可降解多糖，因其带有大量正电荷，容易制备成纳米微粒，且生物相容性好，塑形容易，已被作为较好的药物载体而广泛应用于组织工程研究。但单一羟基磷灰石构建的材料因无机物的脆性大，尚不能很好地在负重骨修复领域应用。实验证明将羟基磷灰石与壳聚糖复合可以综合2种材料的优点，降低材料的脆性，使抗弯强度增高，将有机相与无机相结合起来，使复合材料具备优异的力学性能与生物性能。现在，越来越多的研究常将两种材料复合，整合2种材料的优点以得到具有更好性能的材料。这类生物材料支架塑形性强，具有良好的生物相容性和可降解性，并且可以避免异体组织中免疫排斥反应，在降解的同时，使种植骨或软骨细胞不断增殖，起到修复骨缺损的作用。淫羊藿苷在体内需要合适的载体才能较好的发挥其生物学活性, 纳米粒子或微囊的体积超微, 作为药物控释的良好载体, 能够直接作用于细胞, 可以增加药物稳定性, 延长药物持续浓度,增强药物疗效, 目前已被广泛应用于组织工程领域，而骨组织工程临床治疗骨缺损已成为骨科研究的热点。而淫羊藿苷纳米颗粒与羟基磷灰石-壳聚糖的结合更是综合了传统中医药的优势，近年来相关方面的研究虽然仍不多，但却已吸引了大批学者的浓厚兴趣。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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不同浓度淫羊藿苷修复骨损伤：争议与探索

Different concentrations of icariin for bone defect repair: disputes and exploration

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